Cos'è il metodo di Kjeldahl

Ti sei mai chiesto come capire quante proteine ci sono in un alimento? Ti sei sicuramente imbattuto nel metodo di Kjeldahl, una procedura piuttosto datata ma ancora oggi molto in voga.

Dopo aver letto questo articolo riuscirai senza dubbio a capire come determinare il contenuto in azoto delle sostanze (organiche e non) con il metodo di Kjeldahl.

 

Come funziona il metodo di Kjeldahl

Caratterizzato da 3 passaggi:

  1. Digestione
  2. Distillazione in corrente di vapore
  3. Retrotitolazione

Il campione di cui si vuole determinare il contenuto in azoto deve essere esattamente pesato. La strumentazione da utilizzare comprende un pallone a collo lungo oppure (più recente) un provettone dotato di guarnizione all'interno del quale deporre il campione.

Al campione si va ad aggiungere acido solforico concentrato (H2SO4), ed il pallone (o provettone) portato su piastra riscaldante (si arriva intorno ai 400 °C). Il collo lungo del pallone serve proprio a controllare gli schizzi dovuti all'ebollizione tumultuosa dell'acido solforico. E' chiaro che queste condizioni richiedono obbligatoriamente lavoro sotto cappa aspirante. All'acido solforico si aggiungono oggi delle pasticche di sali di Selenio che servono ad aumentarne la T di ebollizione e a migliorare quindi la resa della reazione.

Lo scopo di questo passaggio è infatti quello di mineralizzare l'azoto organico, in parole più semplici quello di trasformare l'azoto organico (ad esempio quello proteico, -NH2) in sali di azoto inorganico, ovvero, essenzialmente, ammonio solfato [(NH4)2SO4]. Tutto il resto della materia organica è decomposto ad H2O e CO2, tutti i sali in solfati. Questa fase del metodo di Kjeldahl è chiamata anche "Digestione". A questo livello è opportuno non sporcare il collo del pallone con il campione per non falsare l'analisi. Potremmo schematizzare la digestione con questa reazione:

campione + H2SO4(aq)   (NH4)2SO4(aq) + CO2 + SO2+ H2O

A questo punto si lascia raffreddare il pallone e si passa alla seconda fase, chiamata "Distillazione". La soluzione acida contenuta nel nostro pallone viene neutralizzata con un volume noto di soda (NaOH); nei sistemi più moderni questa operazione viene effettuata automaticamente. Dopo aver neutralizzato l'acido solforico si aggiunge un eccesso di soda per spostare lo ione ammonio ad ammoniaca, secondo la reazione:

NH4+ + OH-      NH3 + H2O

Ecco che inizia la distillazione in corrente di vapore. L'apparecchiatura per il metodo di Kjeldahl prevederà una caldaia in cui l'acqua viene riscaldata e portata all'ebollizione. Il vapore prodotto, andando a gorgogliare nella soluzione iniziale, la riscalderà e trascinerà con sé i componenti più volatili della miscela, in questo caso proprio l'ammoniaca. Acqua e ammoniaca nello stato di vapore passano attraverso un tubo dove verranno poi ricondensate (tramite un refrigerante) e fatte gocciolare in una beuta che contiene una soluzione a titolo noto di acido solforico (n.b. beuta e tubo sono collegati ermeticamente, altrimenti perderei ammoniaca).

Cosa succede adesso?
E' estremamente semplice. Le soluzioni acquose di ammoniaca sono basiche, quindi quello che stiamo facendo non è altro che sgocciolare un pò di base in una soluzione acida. Dal punto di vista chimico, l'ammoniaca (base debole) consumerà parte dell'acido solforico (acido molto forte) secondo una semplice reazione acido-base.

Al posto dell'acido solforico possiamo considerare un acido forte generico HX.

E quindi, come si determina la quantità di ammoniaca prodotta?

Questa domanda ci porta alla terza e ultima fase, la "Retrotitolazione" . Con una base forte (es. NaOH) si titola l'eccesso di acido forte rimasto (che non ha reagito con l'ammoniaca). Se non si utilizza una strumentazione moderna, il punto finale della reazione di titolazione può essere messo in evidenza per via colorimetrica utilizzando ad esempio come indicatore la fenolftaleina.

Conoscendo gli equivalenti di acido forte che inizialmente ho messo nella beuta, per differenza, si calcolano gli equivalenti di acido che hanno reagito con l'ammoniaca. E' ovvio che allo stesso tempo si scopre anche quanta ammoniaca avevamo prodotto in fase di digestione! Gli strumenti più moderni si avvalgono anche di un titolatore automatico, che grafica il cambiamento di pH in funzione degli mL di soda aggiunti alla beuta. Questi sistemi sono in grado di valutare in modo molto preciso il punto finale della reazione e addirittura di mostrare subito la % proteica nel campione iniziale (tramite calcoli pre-impostati).

...Riassumendo

  1. Tutto l'azoto organico viene trasformato in ammonio (inorganico)
  2. L'ammonio viene trasformato tramite una base forte in ammoniaca, che viene distillata in corrente di vapore e ricondensata in una beuta contenente acido a titolo noto.
  3. L'eccesso di acido che non ha reagito con l'ammoniaca può essere retrotitolato con la soda e per differenza si può risalire agli equivalenti di N contenuti nel campione iniziale.

In questo articolo abbiamo mostrato in cosa consiste il metodo di Kjeldahl e i presupposti teorici su cui si basa. Se vuoi scoprire anche quali calcoli bisogna fare per risalire al contenuto proteico % ecco una spiegazione dettagliata:

Calcoli per il metodo di Kjeldahl 

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