Luminescenza molecolare: fluorimetria, fosforimetria e spettroscopia Raman

Analizzeremo vari metodi nei quali la radiazione è assorbita da specie molecolari e riemessa con una variazione della lunghezza d’onda. Per iniziare a dare un’idea sui fenomeni di luminescenza molecolare, citiamo la più visibile differenza tra fluorescenza e fosforescenza; Quest’ultima molte volte persiste per molti secondi dopo che l’eccitazioni è stata rimossa, invece la fluorescenza svanisce nel giro di pochi secondi.

Fluorimetria

Durante il processo di eccitazione la maggior parte delle molecole colpite acquisisce energia sia vibrazionale che elettronica passando in stati vibrazionali ed elettronici eccitati. Dopodichè la tendenza delle molecole è quella di scendere a più bassi livelli vibrazionali perdendo energia attraverso collisione che avvengono nella discesa al livello sottostante. Questo precesso non radiativo si ferma appena gli elettroni della molecola eccitata hanno raggiunto il livello elettronico eccitato di singoletto; a questo punto possono avvenire due cose:

  • L’elettrone della molecola eccitata ritorna direttamente al livello non eccitato (“ground state”) emettendo un fotone à FLUORESCENZA
  • L’ elettrone della molecola eccitata shifta (si sposta/passa) ad un livello di tripletto (metastabile) prima di emettere radiazioni à FOSFORESCENZA

Infine, in entrambi i casi, le molecole possono finire in uno qualsiasi degli stati vibrazionali del ground level; questo è il motivo per cui gli spettri sia della fluorescenza che della fosforescenza consistono, generalmente, in tante linee vicine tra loro (spesso si hanno nelle lunghezze d’onda del visibile). Inoltre se è presente un solvente le linee risultano essere estese e fuse tra loro dando vita ad uno spettro simile a quelli visti nell’UV-VIS.

 

 

 

Come si nota dalla figura le molecole eccitate ad un livello vibrazionale del livello elettronico S1 decadono al livello S1 prima di produrre fluorescenza, questo comporta che, nella maggior parte dei casi, l’energia che viene emessa per fluorescenza è minore dell’energia che è servita per eccitare la molecola.

Dal momento che si origina la fluorescenza nel campione, essa viene emessa ugualmente in tutte le direzioni e potrebbe essere, in teoria, osservata da qualsiasi angolazione si voglia. Nella pratica sono però utilizzate tre differenti geometrie di osservazione.

  1. è la più conveniente, è selezionata per tutti i fluorimetri economici;
  2. L’osservazione con un piccolo angolo è vantaggiosa se la soluzione è molto concentrata in quanto la maggior parte degli assorbimenti e quindi, di conseguenza, la maggior parte della fluorescenza, avviene vicino alla superficie irradiata; questa configurazione è inoltre utilizzata se la soluzione assorbe apprezzabilmente nella lunghezza d’onda della fluorescenza, perchè la radiazione emessa ha bisogno di attraversare solo un piccolo spessore della soluzione;
  3. (non c’è niente da dire di importante su questa geometria)

L’approccio matematico alla fluorescenza risulta essere molto complicato rispetto a quello fatto nelle tecniche di assorbimento. È presente però un caso semplice dove è presente in una soluzione diluita un singola specie che assorbe e da fluorescenza. Questo caso è governato dalla seguente equazione matematica:

La fluorescenza è quindi un’utile strumento analitico per veramente piccole concentrazioni, molto più piccole rispetto alle misurazioni per assorbimento dette in precedenza.

 

 

Quenching

Il nome sta a significare la riduzione dell’intensità della fluorescenza ( o fosforescenza) causata da specifici effetti dei costituenti della soluzione stessa. Il quenching puà verificarsi come il risultato di un eccessivo assorbimento della radiazione primaria o di quella di emissione da parte della soluzione stessa (questo fenomeno è chiamato concentration quenching o effetto del filtro interno). Se l’effetto è prodotta dalla fluorescenza della sostanza stessa viene invece chiamato self-quenching.Il quenching può esser causato da una perdità di energia in modo non radiativo da parte delle molecole eccitate. Gli agenti quenchianti facilitano la conversione di molecole eccitate nello stato di singoletto nello stato di tripletto nel quale passaggio non ha luogo l’emissione. Infine esiste il chemical quenching che è qualche volta nominato in caso di riduzione di emissione causata dal cambiamento della natura chimica della sostanza fluorescente; comunemente si nota questo fenomeno al cambiamento del pH della soluzione. Inoltre la quantità di fluorescenza di molti composti dipende dalla temperatura.

Se volessimo valutare il processo di smorzamento della fluorescenza (quenching) dovuto alla presenza di una sostanza, potremmo utilizzare la seguente equazione di Stern-Volmer:

Dove:

è la quantità di radiazione di fluorescenza emessa in assenza della sostanza Q (quencher)

è la quantita di radiazione di fluorescenza emessa in presenza della sostanza Q

è la concentrazione della sostanza Q (che è fissata e costante)

Applicazioni della fluorimetria

La fluorimetria è nota per la sua alta sensibilità, però risulta essere molto selettiva dal momento che un minor numero di composti da efficientemente fluorescenza con un semplice assorbimento di radiazione. Una fluorescenza visibile ha luogo principalmente in 2 classi di sostanze:

  • Una larga varietà di minerali e solidi inorganici fosforici
  • Composti organici ed organometallici con un esteso assorbimento ultravioletto.

Per quanto riguarda le applicazioni possiamo citare:

  • Metodi per determinare tracce di uranio in acqua naturale e nelle rocce
  • Applicazione organica nella determinazione di molecole policicliche, incluse molte sostanze importanti dal punto di vista biochimico e farmaceutico.
  • Determinazione della vitamina B2

Raman spectroscopy

Nella figura precedente il passaggio IX suggerisce che sotto determinate circostanze un fotone può trasferire temporaneamente energia ad una molecola indipendentemente dal suo contenuto di energia; in questo modo la molecola viene elevata ad un “virtuale” livello denominato R. Questo livello non corrisponde ad una posizione stabile e quindi la molecola ritorna immediatamente al ground state. Nella discesa al groung state la molecola può:

  • Fermarsi in uno stato vibrazionale eccitato emettendo fotoni di minor energia rispetto a quella del fotone incidente
  • Tutti gli altri casi sono rappresentati nella figura precedente

Nella spettroscopia Raman viene spesso utilizzata come sorgente un LASER

Le applicazione della spettroscopia Raman sono:

  • È utile nell’identificazione di uno spettro IR
  • Può essere utilizzata anche un analisi quantitative
  • Utile nel esaminare la presenza di sostanze in tracce di soluzioni che necessitano filtrazioni perfette

Scattering

L’apparato di misurazione di scattering ed emissione della luce è sopra raffigurato. Il flusso di energia raccolto dal detector è dato dalla seguente equazione:

Dove:

è il coefficiente di scattering

è il volume di scattering

è l’angolo solido

è l’intensità della radiazione che incide sul volume di scattering

Esistono due tipi di scattering:

  • Scattering Raman: consiste nella diffusione anelastica di fotoni. In genere un fascio di luce che incide sul campione lo attraversa senza subire modifiche o viene assorbito, ma una piccola percentuale viene diffusa con una frequenza piu alta o piu bassa di quella originaria;

 

  • Scattering di Rayleigh: e lo scattering elastico di un'onda luminosa provocato da particelle piccole rispetto alla lunghezza d'onda dell'onda stessa, che avviene quando la luce attraversa un mezzo sostanzialmente trasparente. Sostanzialmente una piccola parte del fascio incidente sul campione viene riflessa con la medesima frequenza.

 

Il laser

Per comprendere i processi legati alla radiazione laser è necessario introdurre le nozioni riguardanti le interazioni fra un’onda elettromagnetica e la materia. Un atomo se eccitato, cioè quando ha un elettrone di valenza ad un livello energetico superiore, può decadere in due modi diversi : radiativo e non radiativo; la cui differenza sta nella forma in cui l’energia acquistata viene dispersa. Quello che noi andremo ad analizzare è il modo radiativo, il quale disperde energia sottoforma di onda elettromagnetica.

Il principio fisico sul quale si fonda la tecnologia laser è quello del salto di livello elettronico degli atomi interessati al fenomeno; chiamiamo E1 ed E2 le energie corrispondenti a due livelli dello stesso atomo e supponiamo E1 < E2; Ci sono tre possibili tipi di interazione tra un sistema atomico e la luce:

 

  • ASSORBIMENTO:

Se una luce (fotoni) di frequenza ν (risonante) passa attraverso un gruppo di atomi che si trovano allo stato fondamentale, esiste la possibilità che la radiazione venga assorbita dagli stessi, causando la transizione su uno stato energetico eccitato. La probabilità di assorbimento è proporzionale a due fattori: l'intensità della radiazione e la popolazione dello stato fondamentale.

  • EMISSIONE SPONTANEA:

Se un certo numero di atomi si trovano nello stato eccitato, può avvenire un decadimento spontaneo allo stato fondamentale con una possibilità proporzionale al numero di atomi dello stato eccitato. La differenza in energia tra i due stati viene emessa dagli atomi sotto forma di fotoni di frequenza v (risonante). I fotoni sono emessi in maniera casuale, e non ci sono relazioni di fase tra i fotoni emessi dal gruppo di atomi in diseccitazione; in altre parole, l'emissione spontanea avviene in maniera incoerente, come in una normale lampadina.

  • EMISSIONE STIMOLATA:

Se un atomo si trova già nello stato eccitato, potrebbe essere perturbato dal passaggio di un fotone dotato di una frequenza ν (risonante) corrispondente a quella di transizione tra lo stato eccitato e lo stato fondamentale. In questo caso l'atomo eccitato collassa allo stato fondamentale inducendo la produzione di un secondo fotone di frequenza v (risonante). Il fotone originale non è assorbito dall'atomo, e così il risultato complessivo sono due fotoni di medesima frequenza. Il numero di fotoni prodotti da emissione stimolata nell’unità di tempo è proporzionale alla popolazione del livello E2 ed alla densità di energia dell’onda incidente. Il fotone emesso è inviato nella stessa direzione del fascio che lo ha originato e la sua propagazione segue l'andamento del medesimo fascio; quindi i due fotoni emessi sono coerenti. Questa proprietà permette l'amplificazione ottica, e la produzione del sistema laser.

Durante l'intera fase di “laseraggio” avvengono tutti e tre i tipi di interazione luce-materia sopra descritti. Inizialmente gli atomi vengono portati allo stato eccitato mediante un processo detto di pompaggio; alcuni di questi atomi decadranno per  emissione spontanea, rilasciando luce incoerente sotto forma di fotoni. Alcuni di questi fotoni verranno assorbiti dagli atomi dello stato fondamentale e andranno persi nel fenomeno del laseraggio. Altri fotoni andranno a causare emissione stimolata negli atomi eccitati, che reagiranno rilasciando un ulteriore fotone coerente dando origine all'amplificazione ottica. Infine per far si che il processo di emissione domini, più semplicemente il laser dia i suoi risultati, è necessario che la popolazione (numero di atomi) del livello con maggiore energia (E2) sia maggiore della popolazione del livello con minore energia (E1), arrivando così a quella situazione chiamata inversione di popolazione.

Fibra ottica

 

La fibra ottica è un cavo formato da due strati denominati core e cladding di materiale trasparente simile al vetro, ma flessibile. I due stratim uno concentrico all’altro, hanno indici di rifrazione differenti. Questo permette ad un segnale luminoso generato da un led o da un laser di viaggiare per decine o centinaia di chilometri senza disturbi o attenuazioni. Inoltre il segnale non risente di interferenze elettromagnetiche.

Le applicazioni della fibra ottica sono innumerevoli, una di queste è la seguente:

Fiber Optic Chemical Sensor (F.O.C.S.)

 

Fiber Optic Chemical Sensors (F.O.C.S.): solitamente viene utilizzata per avere informazione sugli analiti presenti nell'ambiente circostante il FOCS. Essi possono essere catalogati come estrinsechi ed intrinsechi. I primi utilizzano semplicemente una fibra ottica per il trasporto di luce. Un esempio e il Laser-Induced Fluorescence (LIF) (utilizzato in situ solitamente per la rilevazione di contaminanti organici), nei quali la fibra ottica e solo un condotto attraverso il quale la luce viene

trasportata ad un detector. I secondi invece utilizzano questa direttamente come detector rimuovendo una porzione di rivestimento con uno strato chimicamente selettivo, il quale per interazione con l'analita crea un cambiamento nell'assorbimento, riflessione, fluorescenza o polarizzazione della luce.

 

Optical Remote Sensors (ORS)

 

Riportiamo i vantaggi derivanti dall'utilizzo di tale apparecchiatura:

 

  • Monitoraggio di zone inaccessibili o difficili da campionare
  • Misure “path-averaged”, utili per monitorare in continuo situazioni in evoluzione ed eventi di rilascio
  • Tempi di risposta immediati
  • Non è necessaria la raccolta di campioni di aria, non e quindi necessario mettere in atto le cure del caso per la salvaguardia della sua integrita e rappresentativita fino al momento delle analisi
  • In certi tipi e possibile operare la misura contemporanea della concentrazione di piu gas

 

D'altra parte vi sono anche svantaggi:

 

  • Costo elevato
  • interferenze spettrali (acqua, CO2, O3 ed altri)
  • database non ancora completi
  • mancanza di criteri di equivalenza tra O.R.S. ed analisi tradizionali
  • la concentrazione minima apprezzabile e/o la risoluzione spaziale possono essere piu o meno adeguate alle esigenze di monitoraggio

 

Gli O.R.S. vengono impiegati nella misura remota per via ottica di gas d'interesse ambientale. Questi rivestono e rivestiranno sempre piu un ruolo importante nel monitoraggio ambientale, in particolare nella segnalazione di eventi in rapida evoluzione e di rilasci accidentali. Il rischio immediato e quello residuo dopo un certo evento possono essere seguiti al fine di poter intervenire con cognizione di causa. Rispetto al tradizionale sistema di campionamento o monitoraggio in punti definiti, la tecnica ORS presenta un certo numero di vantaggi e svantaggi, i quali sono stati sopra riportati.

 

Gli Optical Remote Sensors si dividono in:

Broad band:

  • FTIR (Fourier trasform. I.R)
  • DOAS (Differential Optical Absorbition Spectroscopy)
  • radiometria

 

Monocromatici:

  • LIDAR (Light Detection And Ranging (laser pulsato)): una tecnica di rilevamento

che permette di determinare la distanza di un oggetto o di una superficie utilizzando

un impulso laser, oltre a determinare le concentrazioni delle specie chimiche in

atmosfera. La distanza dell'oggetto e determinata misurando il tempo trascorso fra

l'emissione dell'impulso e la ricezione del segnale retrodiffuso. La sorgente di un

sistema LIDAR e un laser, ovvero un fascio coerente di luce ad una ben precisa

lunghezza d'onda, che viene inviato verso il sistema da osservare. La tecnologia

LIDAR ha applicazioni in geologia, sismologia, rilevamento remoto e fisica

dell'atmosfera.

  • DIAL (Differential Absorbition Laser (laser continui λon e λoff) o Differential

Absorbition Lidar (laser pulsanti))

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